Лабораторная диагностика (анализы) животных, статьи. Ветклиника Котофей, Днепр

Креатинин и методы определения его концентрации в анализах крови и мочи животных

Деталі

Перегляди: 1595

Креатинин и методы определения его концентрации в анализах
биологических жидкостей (крови и мочи) при лабораторной диагностике

Креатинин (1-метилгликоциамидин) – один из конечных продуктов азотистого обмена в организме у всех позвоночных, в том числе и у человека. В организме креатинин образуется из креатина вследствие азотистого обмена аргинина, глицина и метионина.

Синтез креатинина происходит двухэтапно: сперва в результате перенесения амидной группы из аргинина на глицин образуется гуанидин уксусная кислота (GAA) (в почках и поджелудочной железе эта реакция катализируется энзимом глицинамидинтрансферазой), далее происходит метилирование гуанидин уксусной кислотой в печени и поджелудочной железе при участии S-аденозинметионина, который катализируется гуанидинацетатметилтрансферазой. Из печени и поджелудочной железы креатинин с током крови попадает в другие органы.

Приблизительно 2% всего креатинина неэнзиматичным путём (в следствии неэнзиматической деградации) преоборазуется в креатинин и выводится с мочёй.

В скелетных мышцах и тканях головного мозга в результате обратной реакции перенесения фосфореальной группы АТФ на креатинин образуется креатинфосфат – высокоэнергетическое соединение, выполняющее роль донора энергии, необходимой для реализации мышечных сокращений, активного транспорта ионов в нервных тканях и др.. Эта реакция катализируется энзимом креатинкиназой (креатинфосфокиназой), множественные формы которой присутствуют в разных тканях.

Креатинин – безпороговое вещество, он выделяется с мочей, а уровень его содержания  в моче и сыворотке крови обсуловлен в основном мышечной массой и выделительной функцией почек. Поэтому увеличение уровня креатинина, как правило, говорит про снижение функциональной активности почек.

Определение концентрации креатинина в крови и моче используют для рассчета величины клубочковой фильтрации и оценки функции почек (проба Реберга). Кроме этого, содержание креатинина в лабораторной практике является одним из биохимических показателей для диагностики гиперазотемии и гипертиреоза.

Уровень креатинина увеличивается после использования некоторых препаратов, в результате обезвоживания организма, после механических и операционных повреждений тканей мышц.

Понижение уровня креатинина наблюдается во время голодовки, вегетарианской диеты, при снижении мышечной  массы, в период беременности и после употребления кортикостероидов.

Измеряя креатинин, нужно учитывать, что в организме кроме эндогенного есть ещё и экзогенный креатинин, который  поступает с мясной пищей.

На сегодня существует несколько методов для определения креатинина среди других метаболитов в биологических жидкостях. Эти методы можно условно разделить на три освновные группы.

К первой группе относятся колориметрические методы на основе реакции Яффе (Jaffe), которая была предложена в 1886 году и заключается в взаимедействии креатинина с пикриновой кислотой в щелочной среде с образованием таутомера пикрата креатинина оранжевого цвета. В клиническую практику эту реакцию ввел О.Фолин в 1904 году. Благодаря простоте и относительной дешевизне выполнения этот способ используют и сегодня в большинстве лабораторий.

Однако, реакция Яффе является низкоспецифической в случае проведения анализа в биологических жидкостях, так как пикриновая кислота взаимодействует с более чем 20% некреатининовых хромогенов (протеинами, глюкозой, ацетоном, билирубином, цефалоспоринами, ацетоуксусной, пировиноградной кислотами и др.) с образованием соединений, которые поглощают в том же самом участке что и пикрат креатинина. В общем случае, любое вещество, имеющее активную метильную группу, может реагировать с пикратом. В реакцию с щелочным пикратом может вступать так же ряд препаратов (аспирин, ампицилин, фуросемид, антибиотики цефалоспоринового ряда и др.), а так же антикоагулянты (ЭДТА, гепарин, цитрат, оксалат).

Это привело к необходимости поиска модификаций, направленных на улучшение специфичности метода Яффе. Долгое время для повышения специфичности метода Яффе подбирали такие условия, при которых влияние интерферирующих веществ на формирование комплекса креатинин-пикрат является минимальным, либо количество их можно было бы точно оценить.

Для этого использовали такие приёмы:

• определяли поглощение различных интереферирующих веществ после расщепления креатинина микроорганизмами Corynebacterium ureafaciens;
• выводили подобные соединения из реакционной среды с использованием различных адсорбентов;
• выделяли креатинин из используемого материала и проводили цветную реакцию;
• определяя креатинин, белки плазмы или сыворотки осаждали вольфраматом натрия,  трихлоруксусной или пикриновой кислотой, которые считались более специфичными осадителями.

Однако, это не устраняло полностью интерференцию с другими веществами и не обеспечивало точных результатов. Для связывания глюкозы и аскорбиновой кислоты в реакционной смеси использовали соли борной кислоты.

Еще одним примером повышения специфичности способа измерения креатинина является метод, который основан на принципе Слота, согласно которому пикрат креатинина обесцвечивается в щелочной среде. Реакцию исследуемого образца с пикриновой кислотой проводят последовательно в щелочной и кислой среде, при этом в щелочной среде образуются комплексы оранжевого цвета как с креатинином так и с вышеупомянутыми интерферирующими веществами. Однако, в кислой среде обесцвечивается только пикрат креатинина. Определение концентрации креатинина в образце подсчитывают по разнице оптической плотности раствора в щелочной и кислой среде, которая пропорциональна концентрации креатинина.

Проблемы, связанные с невысокой специфичностью метода Яффе, побуждали ученых к поиску других методов, которые мы условно отнесём к второй группе медотов.

Прежде всего, это высокоэффективная жидкостная хроматография, ионная хроматография, мицелярная электрокинетическая хроматография, хроматографический метод с использованием флюоресцентных индикаторов, капиллярный электрофорез, капиллярный зональный электрофорез, капиллярный изатахофорез, тандемная масс-спектрометрия.

Большинство классических методов имеют существенные недостатки, такие как необходимость предварительной обработки образцов и необходимость в дорогом оборудовании, в некоторых случаях для них характерна недостаточная специфичность. В некоторых случаях комбинируют методы с тем или иным успехом.

Интенсивное развитие метода началось в 80-х годах прошлого столетия, что было обусловлено развитием техники и появлением капилляров с малым внутренним диаметром и переходом к прямому спектрофотометрическому измерению исследуемых образцов непосредственно в капилляре. Метод базируется на разделении компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приведённого электрического поля.

Кроме распространенных методов для определения креатинина всё чаще используют биосенсорные устройства, которые относятся к третьей группе методов. На сегодня разработан ряд энзиматических методов определения концентрации креатинина, которые являются более специфичными и безопасными по сравнению с методами на основе реакции Яффе, поскольку исключают применение агрессивных реагентов (в частности взрывоопасной пикриновой кислоты).

Анализ литературных источников свидетельствует о том, что расширение сферы использования биосенсоров на сегодня обусловлено не только высокой чувствительностью этих систем, но и тем что разработанный биосенсор включает в себя весь набор реагентов, необходимых для определения концентрации анализируемого вещества, а это позволяет свести процедуру анализа к одному-двум этапам. В таком случае можно говорить и о возможности автоматизации процесса.

На сегодня существуют амперометрические, потенциометрические и оптические биосенсоры для определения креатинина. Каждый из них имеет как преимущества, так и недостатки.

Проведенный анализ литературы, посвященной методам измерения креатинина в биологических жидкостях, указывает на то, что на сегодняшний день большинство методических проблем, связанных с его определением помощи химических и энзиматических методов, решено.

Референтные интервалы в случае использования более специфических энзиматических методов обычно несколько ниже по сравнению с методами, которые базируются на методе Яффе. Это можно объяснить более выраженной специфичностью энзиматического метода по сравнению с методом Яффе и перекрестными влияниями других веществ в реальном образце.

На основании вышеизложенного можно сделать вывод, что наиболее перспективными аналитическими методами определения креатинина в биологических жидкостях в повседневной лабораторной практике могут быть биосенсорные методы, которые базируются на использовании как природных энзимов так и искусственных аналогов билогических рецепторов, способных селективно распознавать этот метаболит.

Основными достоинствами биосенсорных методов являются небольшой расход реактивов, отсутствие необходимости в слишком дорогостоящем оборудовании, возможность проведения анализов в режиме реального времени.

Недостатком ферментативного метода является относительная дороговизна реактивов по сравнению с методом Яффе.

Измерение креатинина в основном используется при диагностике и лечении заболеваний почек.

В конце 2020 года в лаборатории ветклиники Котофей впервые в г. Днепр внедрён перспективный, наиболее специфичный  и точный ферментативный метод определения концентрации креатинина в биологических жидкостях пациентов (анализы крови и мочи). Определение креатинина распространённым в большинстве лабораторий методом Яффе (Jaffe) доступно в нашей лаборатории с 2014 года.

Методика проведения анализа и оборудование в лаборатории ветклиники Котофей позволяет уверенно линейно измерять креатинин ферментативным методом в метаболитах с концентрацией от 20 до 7000 мкмоль/Л, что с запасом перекрывает необходимый диапазон значений и обеспечивает высокое качество и достоверность диагностики.

Практическое использование метода в течение года при диагностике реальных пациентов показало высокую диагностическую точность и надежность, соответствие полученных результатов клиническому состоянию пациентов, корреляцию с другими биохимическими показателями в анализе крови животных.

Статья подготовлена по материалам научных публикаций, в том числе с использованием материалов Національній академії наук України.

Сделать клинический (общий) и биохимический анализ крови, измерить Креатинин (Creatinine) ферментативным методом можно в независимой лаборатории ветеринарной клиники Котофей, г. Днепр.